ARNm délivré par voie intradermique

Jun 08, 2024

Nature Biomedical Engineering volume 7, pages 887-900 (2023)Citer cet article

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Le succès des thérapies à base d’ARN messager dépend en grande partie de la disponibilité de systèmes de délivrance permettant la traduction sûre, efficace et stable du matériel génétique en protéines fonctionnelles. Nous montrons ici que les vésicules extracellulaires (VE) produites par nanoporation cellulaire à partir de fibroblastes dermiques humains et encapsulant l'ARNm codant pour le collagène de type I α1 de la matrice extracellulaire (COL1A1) ont induit la formation de greffons de collagène-protéine et réduit la formation de rides dans le collagène. tissu cutané appauvri de souris à peau photovieillie. Nous montrons également que l’administration intradermique des EV chargés d’ARNm via un réseau de micro-aiguilles a conduit à la synthèse et au remplacement prolongés et plus uniformes du collagène dans le derme des animaux. L’administration intradermique d’ARNm COL1A1 à base d’EV peut constituer une thérapie de remplacement des protéines efficace pour le traitement de la peau photovieillie.

Les développements récents dans les techniques de modification de l'ARN messager ont amélioré l'efficacité thérapeutique de l'administration d'ARNm et son potentiel pour des applications cliniques à court terme, y compris la thérapie de remplacement des protéines et la vaccination contre le virus du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2)1, 2. Cependant, l’incapacité intrinsèque et l’immunogénicité potentielle des ARNm nécessitent qu’ils soient encapsulés dans des véhicules de distribution. Les modalités actuelles de délivrance d’ARNm se concentrent sur l’utilisation de supports de nanoparticules lipidiques (LNP) pour l’encapsulation et le transport3,4. Cependant, les LNP posent plusieurs défis majeurs, notamment la cytotoxicité, une mauvaise biodistribution, le manque de spécificité de cible et l'immunogénicité. Ces problèmes peuvent être causés par la nécessité d'une PEGylation de surface (PEG signifie poly(éthylène glycol)) des LNP pour améliorer leur demi-vie circulatoire et réduire la clairance non spécifique5,6. Notamment, l’administration de LNP chez l’homme a été associée à l’anaphylaxie, à l’hypersensibilité et aux événements indésirables auto-immuns7,8. Par conséquent, l’identification de porteurs d’ARNm capables de surmonter certains de ces défis associés au LNP serait utile pour le développement ultérieur de thérapies basées sur l’ARNm.

Les vésicules extracellulaires (VE), notamment les exosomes et les microvésicules, jouent un rôle majeur dans le transport des biomolécules et des acides nucléiques, notamment les ARNm, au sein du corps humain9,10,11. En conséquence, ces dernières années, les véhicules électriques sont devenus des vecteurs prometteurs pour les thérapies à base d’acide nucléique en raison de leur biocompatibilité intrinsèque, de leur capacité à franchir les barrières physiologiques et de leur faible immunogénicité12,13. Contrairement aux LNP, les EV, y compris les exosomes, sont produits de manière endogène par les cellules du corps et entraînent des niveaux plus faibles de réponses inflammatoires. De plus, des stratégies permettant de produire facilement et à moindre coût de grandes quantités d’exosomes ont été développées. Nous avons précédemment signalé une méthode de nanoporation cellulaire (CNP) dans laquelle des pores nanométriques transitoires étaient créés à la surface des cellules sources pour permettre le chargement à grande échelle d'ARNm de transcription complète dans les EV sécrétés14. Ici, en utilisant un modèle murin de photovieillissement aigu qui imite étroitement les caractéristiques physiopathologiques de la peau endommagée par le vieillissement chez l'homme15, nous montrons l'utilité de la thérapie par ARNm COL1A1 basée sur les exosomes pour remplacer la perte dermique de collagène et de protéines en tant que traitement anti-âge pour le photovieillissement. peau. Pour améliorer l'efficacité de l'administration et de la rétention de l'ARNm, nous montrons également que l'administration de l'ARNm du collagène via un patch à micro-aiguilles d'acide hyaluronique (HA) (COL1A1-EV MN) permet une distribution plus efficace de l'ARNm dans le derme, ce qui entraîne un collagène durable. -greffe de protéines et dans un traitement amélioré des rides de la peau photovieillie.

L’atrophie cutanée due à une perte irréversible de collagène est une caractéristique du vieillissement cutané16,17. De nombreuses méthodes ont visé à restaurer la perte de protéines de collagène dans la peau, allant des approches en vente libre et pharmaceutiques (antioxydants18,19,20, rétinoïdes21, peptides22,23) aux dispositifs médicaux (c'est-à-dire la thérapie au laser24 et les produits de comblement cutané synthétiques25,26). . Cependant, aucune de ces technologies existantes n’a permis de remplacer le collagène endogène à long terme afin de maintenir la force, la fermeté et l’élasticité de la peau au fil du temps27,28,29. La stimulation des fibroblastes responsables de la synthèse des protéines de collagène peut également être un moyen efficace de contrôler à court terme le vieillissement cutané30. Cependant, les fibroblastes perdent progressivement leur capacité à proliférer et à synthétiser du collagène au fur et à mesure de leur sénescence, ce qui complique les méthodes de remplacement du collagène à long terme pour le traitement anti-âge31. Pour surmonter ces limitations, nous avons cherché à remplacer la protéine de collagène dans un modèle d'épuisement du collagène par photovieillissement via la délivrance d'ARNm médiée par EV. Pour générer des EV chargés d'ARNm de collagène humain I alpha I (COL1A1), nous avons utilisé une technique CNP qui impliquait l'étalement d'une monocouche de fibroblastes dermiques humains néonatals (nHDF) sur une surface nanopore et la nano-transfection des cellules avec un plasmide COL1A1-GFP ( Fig. 1a et Fig. supplémentaire 1a)14. Les véhicules électriques ont été isolés des milieux de culture le lendemain de la transfection. Il a été constaté que les cellules traitées au CNP avaient un nombre d'EV par cellule 10 fois plus élevé que les cellules traitées par électroporation en masse standard (BEP), réalisée à l'aide d'électrodes parallèles de type cuvette comme décrit précédemment32, ou de nHDF non traités en culture (Fig. .1b). Les véhicules électriques produits par chaque méthode ont été caractérisés par une distribution de taille culminant à environ 150 nm de diamètre, déterminée par analyse de suivi des nanoparticules (NTA) et par 80 % de l'intensité dans le pic de mode par diffusion dynamique de la lumière (DLS) (Fig. 1c et Supplémentaire). Fig. 1b, c) avec un indice de polydispersité (PDI) de 0,12 à 0,25. Les expériences de transfert Western ont montré que les expressions des biomarqueurs des exosomes (CD9, CD63, TSG101) et des microvésicules (ARF6) dans le groupe traité par CNP étaient significativement plus élevées que dans le groupe non traité, confirmant l'augmentation des EV sécrétés (Fig. 1d supplémentaire). Les analyses cinétiques ont en outre montré que la libération d'EV optimisée en tension atteignait son maximum 8 heures après l'induction du CNP, avec une sécrétion continue notée au cours des 24 heures suivantes (Fig. Supplémentaire 1e, f). La réaction en chaîne par polymérase quantitative par transcription inverse (RT – qPCR) a montré que les EV sécrétés par CNP contenaient plus de 200 fois plus d'ARNm de COL1A1 que les EV sécrétés par BEP et 3 000 fois plus d'ARNm de COL1A1 que les EV sécrétés par des cellules non transfectées (Fig. 1d). ). L'évaluation par bioanalyseur du gel d'agarose a démontré une transcription complète de l'ARNm de COL1A1 à environ 4 000 nucléotides (Fig. 1e). Les EV préparés par CNP ont présenté une stabilité structurelle lorsqu'ils ont été stockés pour une administration préclinique à 4 ° C sans changement d'apparence, de propriétés de membrane et de taille lorsqu'ils ont été évalués par microscopie cryoélectronique (cryo-EM), microscopie à force atomique (AFM) et NTA (Fig. supplémentaire .2a à c). De plus, l'ARNm de COL1A1 encapsulé dans les véhicules électriques était stable à la fois à température ambiante et à 4 ° C, et présentait également une stabilité sérique, soulignant ainsi leur potentiel d'utilité clinique future (Fig. 2d, e supplémentaire).